Hrvatski molekularni biolog Boris Lenhard nedavno je u časopisu Nature Communicationszajedno sa svojim kolegama objavio vrlo zanimljiv rad o dijelovima genoma koji se nisu mijenjali stotinama milijuna godina tako da su zajednički i ljudima i pticama i brojnim drugim vrstama, a ključni su za razvoj embrija i vitalnih organa.
Novo otkriće, među ostalim je zanimljivo zbog činjenice da ti ultrakonzervirani dijelovi genoma, koji su dugi od 30 do više od 200 parova baza, formiraju klastere koji obuhvaćaju ogromne kromosomske regije, koje često sadrže na milijune parova. U njihovim sredinama redovito se nalaze geni koji kontroliraju neke važne razvojne funkcije kao što je razvoj vitalnih organa. Ovaj oblik strukture omogućuje da se geni aktiviraju na različite načine u različitim vrstama stanica. Drugim riječima, moglo bi se reći da ti geni imaju velike i složene kontrolne ploče. Poremećaji u tim dijelovima genoma povezani su s deformacijama u embrijima i organima kao i s različitim vrstama karcinoma.
Novi rad povezao je dva područja istraživanja – ona koja se bave tzv. trodimenzionalnom strukturom topoloških domena s onima koja proučavaju strukture genske regulacije kojoj su izloženi geni zaduženi za razvoj embrija, organa poput mozga i sl.
Za bolje razumijevanje nove studije potrebno je shvatiti novije proboje u ova dva područja.
Značajni geni s golemim kontrolnim pločama
Još prije 13 godina nekoliko grupa znanstvenika, uključujući i Lenhardovu, otkrilo je da u genomima postoje neki dijelovi koji su iznimno dobro očuvani, koji se stotinama milijuna godina nisu mijenjali tako da su ostali praktički isti kod različitih kralježnjaka.
„U to vrijeme također smo otkrili da se ti dijelovi u genomu ne pojavljuju nasumično nego u velikim nakupinama, odnosno klasterima", kaže za Index Lenhard sa Sveučilišta Imperial College London.
„U principu, pojedinačni elementi kod čovjeka imaju od 30 do nekoliko stotina parova baza, odnosno slova od kojih se sastoji šifra DNK. No klasteri koje smo mi istraživali prostiru se na dijelovima kromosoma veličine između 500.000 i nekoliko milijuna parova baza. Unutar tih velikih nakupina u pravilu se nalazi po jedan gen koji ima ključnu ulogu u višestaničnom razvoju višestaničnog organizma. To je zapravo fascinantno – kad god se nađe takav klaster, u njemu će se naći i gen čiji će protein imati jednu od ključnih uloga u embrionalnom razvoju, u razvoju organa kao što su primjerice dijelovi mozga, leđna moždina i sl. Za razliku od njih, velika većina drugih gena nema takve strukture oko sebe. Mi smo te strukture nazvali genomskim regulacijskim blokovima", pojasnio je.
Osnovni molekularno biološki testovi pokazali su da većina tih visoko očuvanih elemenata djeluje u svojstvu tzv. pojačivača. Oni će u različitim tkivima i stanicama vezati različite proteine ovisno o tome postoje li takvi proteini u stanici ili ne. Ako se ti proteini vežu na njih, oni će aktivirati gen koji se nalazi u njihovom središtu i pokrenuti određeni razvojni proces. Tu se sad otvorilo pitanje zašto ti geni moraju imati na desetke takvih elemenata oko sebe - inače klasičnih pojačivača oko gena obično ima po nekoliko. U ovom slučaju ima ih na desetke pa i na stotine.
Lenhard kaže da su istraživanja pokazala da je stvar u tome da razvojni geni imaju vrlo komplicirane ekspresije:
„Primjerice, u embriju se nalazi po nekoliko desetaka struktura u kojima jedan takav gen može biti aktivan. Budući da svaki pojačivač može biti aktiviran različitom kombinacijom proteina koji se vežu na njega, možemo reći da gen koji ima 100 takvih elemenata ima vrlo kompliciranu kontrolnu ploču. Drugim riječima, kada imamo mnoštvo različitih pojačivača koji se mogu paliti i gasiti, podrazumijeva se da imamo vrlo složenu aktivnost tog gena u vremenu i prostoru. Primjerice, jedan takav gen u ljudskom je embriju zadužen za razvoj oka, dijela mozga, buduće leđne moždine i još nekoliko struktura (slika dolje)."
Većina tih razvojnih gena kontrolira druge gene ili pak izravno sudjeluje u interakcijama s različitim tipovima stanica. Različite kombinacije tih gena prisutne su u različitim organima i tkivima. Takav gen u biti aktivira druge gene za puno različitih funkcija.
Nevjerojatno otporni na promjene
Lenhard i njegovi suradnici istražili su dijelove genoma koji se nalaze u nakupinama oko tih ključnih gena, a koji predstavljaju kontrolne strukture. Uočili su da su oni nevjerojatno očuvani, da su ostali nepromijenjeni u brojnim organizmima kroz stotine milijuna godina.
„Mi još ne znamo koji je razlog njihove fascinantne očuvanosti. Niti jedan molekularni mehanizam koji poznajemo nije u stanju dovesti do takve evolucijske selekcije da ne dozvoli niti jednu promjenu u nekoliko stotina parova baza. Mi znamo da se i na tim dijelovima genoma događaju mutacije, no one se očito ne toleriraju, a mi ne znamo zašto. Naime, ti pojačivači vežu određene proteine koji ne zahtijevaju baš savršeno očuvanje. Istraživanja su pokazala da te mutacije nisu smrtonosne za one funkcije koje mi razumijemo. Naprotiv, pokazalo se da je moguće uvesti mnogo mutacija, a da one ne uzrokuju smrtne ishode. Prije nekoliko godina jedna skupina znanstvenika kod miševa je uklonila cijeli jedan takav dobro očuvani klaster. Mislili su da bi to moralo ubiti miša kada je taj tako važan, dobro očuvani dio uklonjen. Međutim, ništa se nije dogodilo. Miševi su izgledali, ponašali se i razmnožavali normalno. Međutim, kasnije se ipak pokazalo da ti miševi imaju neke suptilne razlike u načinu na koji se spajaju neuroni u mozgu. U laboratorijskim uvjetima to se ne može uočiti, no u divljini bi to vjerojatno bio nedostatak koji bi doveo do toga da bi oni kroz nekoliko generacija nestali", tumači hrvatski znanstvenik s adresom u Londonu.
Precizno uređenje u prostoru
Druga polovica otkrića koje opisuje novi rad temelji se na razvoju metoda za određivanje kromosomske konformacije (trodimenzionalne strukture koju kromosomi zauzimaju u jezgri stanica) koje su otkrile postojanje tzv. topoloških asocirajućih domena. To je pojava u kojoj se dio lanca DNA u jednom kromosomu presavija i smotava u 3D strukturu. Ona omogućuje mnogo bliskih kontakata unutar određenog segmenta dok je istovremeno cijeli segment izoliran od istih takvih kontakata sa susjednim segmentima istog kromosoma, kao i s ostalim kromosomima. Ove 3D domene otkrivene su neovisno o otkriću ranije spomenutih regulacijskih blokova, isključivo na temelju mjerenja koji dijelovi kromosoma su blizu jedan drugome u staničnoj jezgri.
„Mi smo otkrili da te dvije strukture u genomima - topološke asocirajuće domene i klasteri ekstremno očuvanih nekodirajućih elemenata - duž kromosoma odgovaraju jedne drugima. To znači da te dvije strukture predstavljaju dvije manifestacije jednog te istog fenomena koji ima važnu ulogu u višestaničnoj genskoj regulaciji. Pritom treba znati da su ta dva različita svojstva otkrili različiti, neovisni timovi znanstvenika, potpuno različitim metodama", kaže Lenhard.
Tu su posebno zanimljive dvije stvari.
Kao prvo, kada su otkrivene topološki asocirajuće domene, očekivalo se da će one biti jako dinamične i fluidne, da će se promjene i specijalizacije koje se zbivaju u stanicama tijekom razvoja organizma reflektirati na razlike u njihovom položaju i izoliranosti od ostatka genoma. Međutim, kasnije se pokazalo da su te strukture prilično stabilne u različitim tipovima stanica, neovisno o tome jesu li geni u njima aktivni ili nisu.
„Naše otkriće – da se položaj tih struktura može otkriti i pomoću visoko očuvanih klastera genomskih elemenata znači da se te trodimenzionalne strukture nisu mijenjale stotinama milijuna godina. To pak znači da će iste domene s istim početkom i krajem biti očuvane jednako kod čovjeka i kod ptica, da su one vjerojatno u istom obliku postojale i kod naših zajedničkih predaka. Ono što mi mislimo o regulacijskoj ulozi tih regija je da je njihova svrha da uređuju 3D prostor oko gena koje ti elementi, koji čine klaster, kontroliraju tako da zapravo taj gen i pripadajući regulacijski elementi, koji ponekad mogu biti čak i milijun parova baza udaljeni od njega, što je u linearnom prostoru na kromosomu jako daleko, u stanici budu blizu. Za ilustraciju kod većine bakterija, cijeli genom od tisuću i više gena često stane u nešto više od milijun parova, a ovdje je cijela tolika regija manje-više posvećena regulaciji aktivnosti jednog jedinog gena. Na taj način pojačivači, kada se aktiviraju odmah u blizini, mogu lako pronaći gen koji se mora uključiti. Kada ti segmenti ne bi bili tako razmješteni i izolirani od ostatka gena, pojačivači ne bi mogli učinkovito doprijeti do gena koje trebaju aktivirati, dok bi istodobno mogli utjecati na druge gene koje ne bi trebali aktivirati," tumači naš sugovornik.
Moguća primjena
Budući da se ovdje radi o kromosomskim strukturama i genima koji reguliraju višestanične procese, svaki put kada u njima nešto krene krivo, doći će do razvoja anomalija, najčešće urođenih malformacija.
„Primjerice, neki od tih procesa kontroliraju razvoj udova i prstiju. Ako se jedan od elemenata deaktivira, recimo element koji s udaljenosti od jedne megabaze kontrolira gen SHH, što je kratica od Sonic hedgehog, naziva po liku iz video igrice, doći će do pojave koja se zove preaksijalna polidaktilija – osobi će izrasti šesti prst ili će pak imati potpuno simetrične ruke. Dakle, kada se u toj složenoj kontrolnoj ploči klastera koji kontroliraju gene nešto poremeti, mogu se razviti različite malformacije."
Poznato je također da je veliki dio tih gena s takvim velikim kontrolnim pločama povezan s različitim vrstama raka i neoplazijama. U slučaju ovih gena dovoljno je mutirati njihove kontrole pa da se nešto ozbiljno poremeti.
„Dakle, mi smo u našem radu zapravo povezali dva područja istraživanja. Povezali smo trodimenzijsku strukturu topoloških domena sa strukturom genske regulacije kojoj su izloženi geni za embrionalni razvoj, za razvoj organa poput mozga i sl. Premda još uvijek ne znamo zašto su kontrolni elementi tih gena toliko evolucijski očuvani, sada znamo više o tome koje procese treba proučavati da to otkrijemo", zaključuje Lenhard.
Novo otkriće, među ostalim je zanimljivo zbog činjenice da ti ultrakonzervirani dijelovi genoma, koji su dugi od 30 do više od 200 parova baza, formiraju klastere koji obuhvaćaju ogromne kromosomske regije, koje često sadrže na milijune parova. U njihovim sredinama redovito se nalaze geni koji kontroliraju neke važne razvojne funkcije kao što je razvoj vitalnih organa. Ovaj oblik strukture omogućuje da se geni aktiviraju na različite načine u različitim vrstama stanica. Drugim riječima, moglo bi se reći da ti geni imaju velike i složene kontrolne ploče. Poremećaji u tim dijelovima genoma povezani su s deformacijama u embrijima i organima kao i s različitim vrstama karcinoma.
Novi rad povezao je dva područja istraživanja – ona koja se bave tzv. trodimenzionalnom strukturom topoloških domena s onima koja proučavaju strukture genske regulacije kojoj su izloženi geni zaduženi za razvoj embrija, organa poput mozga i sl.
Za bolje razumijevanje nove studije potrebno je shvatiti novije proboje u ova dva područja.
Značajni geni s golemim kontrolnim pločama
Još prije 13 godina nekoliko grupa znanstvenika, uključujući i Lenhardovu, otkrilo je da u genomima postoje neki dijelovi koji su iznimno dobro očuvani, koji se stotinama milijuna godina nisu mijenjali tako da su ostali praktički isti kod različitih kralježnjaka.
„U to vrijeme također smo otkrili da se ti dijelovi u genomu ne pojavljuju nasumično nego u velikim nakupinama, odnosno klasterima", kaže za Index Lenhard sa Sveučilišta Imperial College London.
„U principu, pojedinačni elementi kod čovjeka imaju od 30 do nekoliko stotina parova baza, odnosno slova od kojih se sastoji šifra DNK. No klasteri koje smo mi istraživali prostiru se na dijelovima kromosoma veličine između 500.000 i nekoliko milijuna parova baza. Unutar tih velikih nakupina u pravilu se nalazi po jedan gen koji ima ključnu ulogu u višestaničnom razvoju višestaničnog organizma. To je zapravo fascinantno – kad god se nađe takav klaster, u njemu će se naći i gen čiji će protein imati jednu od ključnih uloga u embrionalnom razvoju, u razvoju organa kao što su primjerice dijelovi mozga, leđna moždina i sl. Za razliku od njih, velika većina drugih gena nema takve strukture oko sebe. Mi smo te strukture nazvali genomskim regulacijskim blokovima", pojasnio je.
Osnovni molekularno biološki testovi pokazali su da većina tih visoko očuvanih elemenata djeluje u svojstvu tzv. pojačivača. Oni će u različitim tkivima i stanicama vezati različite proteine ovisno o tome postoje li takvi proteini u stanici ili ne. Ako se ti proteini vežu na njih, oni će aktivirati gen koji se nalazi u njihovom središtu i pokrenuti određeni razvojni proces. Tu se sad otvorilo pitanje zašto ti geni moraju imati na desetke takvih elemenata oko sebe - inače klasičnih pojačivača oko gena obično ima po nekoliko. U ovom slučaju ima ih na desetke pa i na stotine.
Lenhard kaže da su istraživanja pokazala da je stvar u tome da razvojni geni imaju vrlo komplicirane ekspresije:
„Primjerice, u embriju se nalazi po nekoliko desetaka struktura u kojima jedan takav gen može biti aktivan. Budući da svaki pojačivač može biti aktiviran različitom kombinacijom proteina koji se vežu na njega, možemo reći da gen koji ima 100 takvih elemenata ima vrlo kompliciranu kontrolnu ploču. Drugim riječima, kada imamo mnoštvo različitih pojačivača koji se mogu paliti i gasiti, podrazumijeva se da imamo vrlo složenu aktivnost tog gena u vremenu i prostoru. Primjerice, jedan takav gen u ljudskom je embriju zadužen za razvoj oka, dijela mozga, buduće leđne moždine i još nekoliko struktura (slika dolje)."
Većina tih razvojnih gena kontrolira druge gene ili pak izravno sudjeluje u interakcijama s različitim tipovima stanica. Različite kombinacije tih gena prisutne su u različitim organima i tkivima. Takav gen u biti aktivira druge gene za puno različitih funkcija.
Nevjerojatno otporni na promjene
Lenhard i njegovi suradnici istražili su dijelove genoma koji se nalaze u nakupinama oko tih ključnih gena, a koji predstavljaju kontrolne strukture. Uočili su da su oni nevjerojatno očuvani, da su ostali nepromijenjeni u brojnim organizmima kroz stotine milijuna godina.
„Mi još ne znamo koji je razlog njihove fascinantne očuvanosti. Niti jedan molekularni mehanizam koji poznajemo nije u stanju dovesti do takve evolucijske selekcije da ne dozvoli niti jednu promjenu u nekoliko stotina parova baza. Mi znamo da se i na tim dijelovima genoma događaju mutacije, no one se očito ne toleriraju, a mi ne znamo zašto. Naime, ti pojačivači vežu određene proteine koji ne zahtijevaju baš savršeno očuvanje. Istraživanja su pokazala da te mutacije nisu smrtonosne za one funkcije koje mi razumijemo. Naprotiv, pokazalo se da je moguće uvesti mnogo mutacija, a da one ne uzrokuju smrtne ishode. Prije nekoliko godina jedna skupina znanstvenika kod miševa je uklonila cijeli jedan takav dobro očuvani klaster. Mislili su da bi to moralo ubiti miša kada je taj tako važan, dobro očuvani dio uklonjen. Međutim, ništa se nije dogodilo. Miševi su izgledali, ponašali se i razmnožavali normalno. Međutim, kasnije se ipak pokazalo da ti miševi imaju neke suptilne razlike u načinu na koji se spajaju neuroni u mozgu. U laboratorijskim uvjetima to se ne može uočiti, no u divljini bi to vjerojatno bio nedostatak koji bi doveo do toga da bi oni kroz nekoliko generacija nestali", tumači hrvatski znanstvenik s adresom u Londonu.
Precizno uređenje u prostoru
Druga polovica otkrića koje opisuje novi rad temelji se na razvoju metoda za određivanje kromosomske konformacije (trodimenzionalne strukture koju kromosomi zauzimaju u jezgri stanica) koje su otkrile postojanje tzv. topoloških asocirajućih domena. To je pojava u kojoj se dio lanca DNA u jednom kromosomu presavija i smotava u 3D strukturu. Ona omogućuje mnogo bliskih kontakata unutar određenog segmenta dok je istovremeno cijeli segment izoliran od istih takvih kontakata sa susjednim segmentima istog kromosoma, kao i s ostalim kromosomima. Ove 3D domene otkrivene su neovisno o otkriću ranije spomenutih regulacijskih blokova, isključivo na temelju mjerenja koji dijelovi kromosoma su blizu jedan drugome u staničnoj jezgri.
„Mi smo otkrili da te dvije strukture u genomima - topološke asocirajuće domene i klasteri ekstremno očuvanih nekodirajućih elemenata - duž kromosoma odgovaraju jedne drugima. To znači da te dvije strukture predstavljaju dvije manifestacije jednog te istog fenomena koji ima važnu ulogu u višestaničnoj genskoj regulaciji. Pritom treba znati da su ta dva različita svojstva otkrili različiti, neovisni timovi znanstvenika, potpuno različitim metodama", kaže Lenhard.
Tu su posebno zanimljive dvije stvari.
Kao prvo, kada su otkrivene topološki asocirajuće domene, očekivalo se da će one biti jako dinamične i fluidne, da će se promjene i specijalizacije koje se zbivaju u stanicama tijekom razvoja organizma reflektirati na razlike u njihovom položaju i izoliranosti od ostatka genoma. Međutim, kasnije se pokazalo da su te strukture prilično stabilne u različitim tipovima stanica, neovisno o tome jesu li geni u njima aktivni ili nisu.
„Naše otkriće – da se položaj tih struktura može otkriti i pomoću visoko očuvanih klastera genomskih elemenata znači da se te trodimenzionalne strukture nisu mijenjale stotinama milijuna godina. To pak znači da će iste domene s istim početkom i krajem biti očuvane jednako kod čovjeka i kod ptica, da su one vjerojatno u istom obliku postojale i kod naših zajedničkih predaka. Ono što mi mislimo o regulacijskoj ulozi tih regija je da je njihova svrha da uređuju 3D prostor oko gena koje ti elementi, koji čine klaster, kontroliraju tako da zapravo taj gen i pripadajući regulacijski elementi, koji ponekad mogu biti čak i milijun parova baza udaljeni od njega, što je u linearnom prostoru na kromosomu jako daleko, u stanici budu blizu. Za ilustraciju kod većine bakterija, cijeli genom od tisuću i više gena često stane u nešto više od milijun parova, a ovdje je cijela tolika regija manje-više posvećena regulaciji aktivnosti jednog jedinog gena. Na taj način pojačivači, kada se aktiviraju odmah u blizini, mogu lako pronaći gen koji se mora uključiti. Kada ti segmenti ne bi bili tako razmješteni i izolirani od ostatka gena, pojačivači ne bi mogli učinkovito doprijeti do gena koje trebaju aktivirati, dok bi istodobno mogli utjecati na druge gene koje ne bi trebali aktivirati," tumači naš sugovornik.
Moguća primjena
Budući da se ovdje radi o kromosomskim strukturama i genima koji reguliraju višestanične procese, svaki put kada u njima nešto krene krivo, doći će do razvoja anomalija, najčešće urođenih malformacija.
„Primjerice, neki od tih procesa kontroliraju razvoj udova i prstiju. Ako se jedan od elemenata deaktivira, recimo element koji s udaljenosti od jedne megabaze kontrolira gen SHH, što je kratica od Sonic hedgehog, naziva po liku iz video igrice, doći će do pojave koja se zove preaksijalna polidaktilija – osobi će izrasti šesti prst ili će pak imati potpuno simetrične ruke. Dakle, kada se u toj složenoj kontrolnoj ploči klastera koji kontroliraju gene nešto poremeti, mogu se razviti različite malformacije."
Poznato je također da je veliki dio tih gena s takvim velikim kontrolnim pločama povezan s različitim vrstama raka i neoplazijama. U slučaju ovih gena dovoljno je mutirati njihove kontrole pa da se nešto ozbiljno poremeti.
„Dakle, mi smo u našem radu zapravo povezali dva područja istraživanja. Povezali smo trodimenzijsku strukturu topoloških domena sa strukturom genske regulacije kojoj su izloženi geni za embrionalni razvoj, za razvoj organa poput mozga i sl. Premda još uvijek ne znamo zašto su kontrolni elementi tih gena toliko evolucijski očuvani, sada znamo više o tome koje procese treba proučavati da to otkrijemo", zaključuje Lenhard.
